Окислення фенолу ковалентно іммобілізованою пероксидазою хрону

Abstract

За модифікованим методом Баха виділено частково очищений препарат пероксидази хрону (RZ = 1,0; активність 100 Од/мг протеїну). Молекулярну масу виділеної пероксидази хрону (42 972 Да) підтверджено методом мас спектрометрії – матрично активованої лазерної десорбції/іонізації. Одержаний препарат був ковалентно іммобілізований шляхом періодатного окиснення полісахаридної мембрани «Діацел» з наступним відновленням боргідридом натрію у масовому відношенні ензим:носій 0,2:1. Отримано біокаталізатор з кількісним зв’язуванням протеїну, зі збереженням 88% активності (масове відношення ензим:носій 0,2:1), розширеними значеннями рН і термооптимумів активності, збільшеною термостабільністю, стійкістю під час зберігання (8 міс). Кінетичні дослідження показали збільшення значень K м за пероксидом водню і пірогалолом, зменшення значень Vmax реакції, яка каталізується іммобілізованою пероксидазою хрону. Розроблений біокаталізатор у реакторі періодичної дії сприяв кількісному окисненню фенолу (1 мМ) упродовж 7 циклів використання та високому рівню його біоконверсії (95–50%) у наступні 15 циклів. Методом лазерної десорбціїї/іонізації вперше визначено молекулярну масу (близько 2 021 Да) нерозчинного у воді і більшості органічних розчинників полімерного продукту пероксидазного окиснення фенолу – поліоксифенілену (розмір частинок 15–75 мкм), що складається з 21 залишку.

According to modified Bakh’s method, partially purified horseradish peroxidase preparation (RZ = 1,0; activity 100 U/mg of protein) was isolated. Molecular mass of obtained HPR (42 972 Da) was confirmed by massspectrometry: matrix activated laser desorption/ ionization. The enzyme was covalently immobilized by periodate oxidation of polysaccharide membrane «Diacell», followed by sodium borohydride reduction, at mass ratio enzyme: support 0.2:1. The biocatalyst with quantitative protein coupling, 88% of activity’s pH- and thermooptima, increased termostability, stable at storage (8 months) was obtained. Kinetic studies had shown the increasing of hydrogen peroxide and pyrogallol Kм values and decreasing of Vmax values during immobilized HPR catalyzed reactions. In the batch reactor the biocatalyst developed promoted the quantitative phenol oxidation (1 mmol/dm3) during 7 cycles of usage and high level of it’s bioconversion (95–50%) during the next 15 cycles. Molecular weight (about 2021 Da) of polymer product, insoluble in water and most organic solvent, of peroxidase oxidation of phenol – polioxyfenilene (particle size is from 15 to 75 mm) consisting of 21 units was first determined by laser desorption/ionization.

По модифицированному методу Баха выделен частично очищенный препарат пероксидазы хрена (RZ = 1,0; активность 100 Ед/мг протеина). Молекулярная масса выделенной пероксидазы хрена (42 972 Да) подтверждена методом масс спектрометрии – матрично активированной лазерной десорбции / ионизации. Полученный препарат был ковалентно иммобилизован путем перйодатного окисления полисахаридной мембраны «Диацелл» с последующим восстановлением боргидридом натрия в массовом отношении энзим: носитель 0,2:1. Получен биокатализатор с количественным связыванием протеина, с сохранением 88% активности (массовое отношение энзим: носитель 0,2:1), расширенными значениями рН- и термооптимумов активности, увеличенной термостабильностью, устойчивостью при хранении (8 мес). Кинетические исследования показали увеличение значений Kм по пероксиду водорода и пирогаллолу; уменьшение значений V max реакции, которая катализируется иммобилизованной ПОХ. Разработанный биокатализатор в реакторе периодического действия способствовал количественному окислению фенола (1 мМ) в течение 7 циклов использования и высокому уровню его биоконверсии (95–50%) в последующие 15 циклов. Методом лазерной десорбции/ионизации впервые определена молекулярная масса (около 2 021 Да) нерастворимого в воде и большинстве органических растворителей полимерного продукта пероксидазного окисления фенола – полиоксифенилена (размер частиц 15–75 мкм), состоящего из 21 звена.